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近两年,蛭弧菌产品的使用又突然火了起来,市面上也出现了各式各样的蛭弧菌产品,有液体蛭弧菌,有粉剂蛭弧菌,还有蛭弧菌冻干粉,尤其是蛭弧菌冻干粉成了推广的新潮流,但是同样都是蛭弧菌冻干粉,有的产品用的很好,有的产品用的却见不到效果,很多养殖户甚至厂家都对蛭弧菌相关产品抱有疑问,本文则希望通过对蛭弧菌知识的初步梳理,为养殖户、经销商、公司更好的理解、使用蛭弧菌产品提供一些思路。
一、到底什么是蛭弧菌?
(一)蛭弧菌基本资料
1、发现及命名
蛭弧菌是在1962年由Stolp和Petzold首次发现于菜豆叶烧病假单胞菌体中,随后从土壤、污水中都分离到了这种细菌。所以蛭弧菌从发现到现在才不过56年的时间。
蛭弧菌命名为Bdellovibrio bacteriovorus。其中,Bdello一词来自希腊字,是“水蛭”的意思,“vibrio”意为“弧菌”,而种名“bacteriovorus”是“食细菌”的意思。其命名很有意思,“水蛭”代表了其生理上的一些动作形为,蛭弧菌的捕食生活方式很特殊,它是寄生于其他细菌并能导致其裂解的一类细菌——请注意,是“裂解”,不是整个吃掉哦。
2、什么是蛭弧菌
蛭弧菌也叫噬菌蛭弧菌,属于细菌界变形细菌门蛭弧菌科蛭弧菌属,具有细菌的一切形态特征:
单细胞,弧形或逗点状,有时呈螺旋状。0.3-0.6×0.8-1.2微米,或仅为杆菌长度的1/3-1/4,端生鞭毛,比其他细菌的鞭毛粗3-4倍,与鞭毛相对的一端有钉状纤毛,被称为“感染锥子”,与菌体的识别和吸附宿主有关。其运动活跃。革兰氏染色阴性。
3、生活方式及生长要求
蛭弧菌有寄生型,也有兼性寄生,极少数营腐生。非寄生型营腐生生活,可在蛋白胨和酵母提取物培养基上生长繁殖。从自然界分离得到的蛭弧菌都是依赖寄生型,迄今为止,还没有直接从自然界分离得到非寄生型。不依赖宿主的蛭弧菌,只能生活在实验室条件下。
寄生型蛭弧菌生长,一般要求pH6.0-8.5;温度23-37℃,低于12℃,高于42℃时均不生长;能稳定分解蛋白质,一般不利用碳水化合物,而以肽、氨基酸作碳源和能源;能液化明胶;严格好氧。
4、寄生的特异性问题
蛭弧菌与宿主细胞之间,常表现出一定的特异性。不过,有的特异性较差,能侵入多种细菌。例如不同的蛭弧菌菌株,能侵入各类不同的植物病原菌。
从这一点上看,其比噬菌体(病毒)、细菌素(蛋白质)的广谱性要好。实际上蛭弧菌可感染许多不同科属的菌,但其总体上有一定偏向性,比如其可感染大多数革兰氏阴性细菌(如志贺氏菌属、沙门氏菌属、埃希氏菌属、欧文氏菌属、变形杆菌属、弧菌属、假单胞菌属、钩端螺旋体等微生物),但只对少数的革兰氏阳性(如粪链球菌、乳酸菌等)细菌感兴趣,比如其就不裂解枯草杆菌,同时也有报道指出其对某些真菌和肠道病毒也有一定的裂解活性。
5、蛭弧菌为什么用双层平板而不用单层平板法检测?
主要的原因在于培养皿底部并不是十分平整,因此注入少量培养基铺平底部作为下层,会获得几近水平的底部,然后在上面将噬菌体和细菌混合物的培养基(比较薄)注入作为上层,这样使得观察物在同一平面,更利于噬菌斑的观察及分离纯化。
实际上单层平板法与双层平板法所形成的噬菌斑的比较图如下:
6、安全性问题
王亚丽(2007年)的研究指出,将分蛭弧菌离株BD5W以107pfu/mL浓度给小鼠灌胃,试验组和对照组均健康,证明噬菌蛭弧菌对小鼠没有毒性作用。
林茂等(2010年)的研究也证实了蛭弧菌作为一种微生态制剂的无毒无害特点。
徐懿(2011年)在噬菌蛭弧菌BD57的急性毒性试验研究指出,根据《兽药试验技术规范汇编》的要求选用小白鼠进行了急性毒性试验。分别采用灌胃和腹腔注射法进行了急性毒性试验,试验结果表明,噬菌蛭弧菌 BD57 对小鼠没有毒性作用。
陈丽芸(2012年)的研究也指出,至今没有发现蛭弧菌对真核细胞有毒的报道,对小白鼠、豚鼠、家兔等动物无毒性作用,对猴肾、Hela细胞组织培养也未引起细胞病变。迄今为止,相关报道表明蛭弧菌对人和某些动物无毒害作用。
二、蛭弧菌的裂解机制
蛭弧菌对于宿主菌的裂解过程一般分为五个步骤:识别、吸附与侵入、定位与合成、复制、裂解。整体示意如下图:
1、识别
在这个过程中,有趣的是蛭弧菌可以通过鞭毛实现跳跃式的运动,而向宿主菌快速移动,其是通过无鞭毛一端粘附于宿主菌表面的。鞭毛在这里起到了非常重要的作用,实际上,在一些发酵的试验研究过程中也发现,如果发酵罐内的浆叶转速过快,对鞭毛有损伤的话,蛭弧菌就无法再攻击宿主。
2、吸附与侵入
为了实现吸附与侵入这个目的,蛭弧菌菌体会以100转/秒以上的速度产生一种机械“钻孔”效应,加上蛭弧菌入侵时的收缩从而进入宿主菌的周质空间
3、定位与合成
一是蛭弧菌会脱掉鞭毛,二是宿主菌会变成蛭质体。
4、复制
蛭弧菌在这个阶段实现了复制繁殖。
5、裂解
在最后一个过程中,蛭弧菌会合成鞭毛,裂解宿主的细胞膜,释放出所有蛭弧菌。
电镜的一些图片如下:
三、蛭弧菌的保存方式研究
黄文等人(2002年)曾对五种蛭弧菌的保存方法做了对比研究,其指出5种保藏方法中以冷冻干燥法保藏效果最好,1个月的复活率为100%,其次为4℃营养肉汤液保藏法和-20℃甘油保藏法,17个月复活率均为67%。
当然,有一点要明确,其冷冻干燥完成之后,是在4℃环境中进行保存的。
另外,邓璐等人(2008年)研究了不同的保护液、保藏温度和保藏载体的选择对蛭弧菌长期保藏的影响,以及对优化保藏条件下的蛭弧菌复苏率和复苏蛭弧菌的噬菌能力检测,并且对保藏期限内宿主菌的存活情况与蛭弧菌的存活情况的相互影响做了首次的报道。结果表明:以1/100NB等低营养液体为保护液、琼脂为载体、加入适量宿主菌于4℃,蛭弧菌保存可达2年以上,保存期内蛭弧菌的复苏率和出斑数目较对照组都有极其显著的提高(P